1.1 细胞分离技术

细胞分离是单细胞测序的第一步， 其准确性将直接影响后续的测序和分析。提高通量、减少样品与试剂的消耗、提高细胞分离捕获的灵敏度和精确性一直是研究者的目标。常用的细胞分离技术包括有限稀释法、 显微操作法、 激光捕获显微分离技术、 拉曼镊子、涡旋与相分隔、荧光激活细胞分选技术和微流控技术。其中微流控技术因其较低的成本、较高的通量和理想的分离效果在近10年发展迅速，成为细胞分离技术的主流方向。
 

1.2 单细胞基因扩增技术

单细胞分离之后需要通过单细胞基因扩增技术使单个细胞内极微量的DNA放大至纳克或微克水平，同时也将较长的 DNA片段化，满足下一步测序的需要。目前常用的方法包括简并寡核苷酸引物 PCR、多重置换扩增技术、多次退火环状循环扩增技术、Tn5 转座酶技术，以及新兴的细胞内融合基因技术。简并寡核苷酸引物 PCR（图 1-A）使用随机简并引物对全基因组进行扩增。由于随机引物退火温度的不均一性，不同序列扩增效率的差异被 PCR 反应成倍放大，产生大量扩增不足的区域，导致基因组覆盖率较低。
 

2017年，Blagodatskikh等改进了该技术并命名为 iDOP-PCR（Improved DOPPCR，新的方案使用具有热稳定性的聚合酶，并调整了引物设计，可显著提高文库质量。多重置换扩增技术是目前环境微生物领域最为成熟也是应用最广的单细胞基因组扩增技术。由于 φ29 DNA 聚合酶具有 3‘-5‘ 核酸外切酶活性和校正活性，因此与 DOP-PCR 相比，多重置 换 扩 增 技 术具有更高的序列覆盖度和保真度，但也存在外源 DNA 污染、序列覆盖不均、嵌合体干扰、序列组装与分析困难等不足。由于 MDA 的偏差在一定程度上是随机的，所以通常可以通过多个数据集的混合拼接来减小这种偏差同时提高组装的完整性。研究表明，2-5 个单细胞扩增基因组数据集混合组装得到的基因组完整性中位数 ＞97％，高于单个单细胞组装完整性的中位数（30％-90％）。
 

随后 Povilaitis 等基于多重置换扩增的原理改进得到全基因组扩增技术 WGA-X，使用耐热的突变体φ29 DNA 聚合酶将延伸温度从 30℃提高到 45℃，大大提高了从 CG 含量高的单个环境细胞或病毒体回收基因组的能力。多次退火环状循环扩增技术（图1-C）通过准线性预放大来减少与非线性放大相关的偏差。该技术利用特殊引物，使得扩增子的结尾互补而成环，从而很大程度上防止了 DNA 的指数性扩增。MALBAC 所使用的引物 3‘ 端是 8 个随机的核苷酸序列，5‘ 端是27个固定的核苷酸序列，最大的特点在于它是准线性扩增而非指数扩增，因此拷贝数变异检测的准确性高且单核苷酸变异，SNV）检测的假阴性率低 ；而且，MALBAC 的偏差具有可重复性，因此可进行降噪和归一化处理。然而，由于该技术使用的 DNA 聚合酶保真度低于 φ29DNA 聚合酶，SNV检测的假阳性率高于 MDA。
 

目前 MALBAC 主要用于医疗诊断，在微生物单细胞的准确组装方面相比 MDA 优势不明显，在微生物生态学领域的应用前景不及 MDA。Tn5 转座酶（图 1-D）最初用于二代测序的文库构建，将 DNA 片段化、末端修复、接头连接等简化为一步，大大简化建库步骤的同时为单细胞测序提供了有力工具。基于 Tn5 转座酶，谢晓亮团队于 2017 年提出了改良的单细胞全基因组扩增方法，用 Tn5 转座子结合 T7 启动子形成的转座复合体随机插入单细胞基因组DNA，将基因组片段化并与 T7启动子连接。随后 T7 启动子行使体外转录功能，用转录获得大量线性扩增的转录本，再经逆转录得到大量扩增产物，进行建库测序。该过程进行的是线性扩增，大大增强了扩增的稳定性，使LIANTI 在遗传疾病的检测方面更加有效和精确。同年，Lan等利用微流控技术将单细胞测序技术的通量提高到50000个细胞 / 次，使得转座酶适用于环境基因组研究。
 

细胞内融合基因技术是单细胞分离技术、融合PCR、巢式PCR和测序技术的结合，广义而言也可归于单细胞测序的范畴。首先，通过稀释和涡旋将样品分散成单细胞体系 ；然后对待研究的系统发育基因和功能基因进行融合扩增 ；随后进行巢式 PCR，建库并进行二代测序。该技术的成本远低于普通单细胞全基因组测序，单次实验的通量可高达107个细胞，在解决物种与功能、种间关系等科学问题方面有良好的应用前景。
 

出自《单细胞测序技术在微生物生态领域中的应用》作者王丹蕊,沈文丽,魏子艳。