首先，使用高浓度ActivinA处理hiPSC3d，诱导其分化为定形内胚层，形成单层细胞片状结构；随后进行中肠/后肠诱导，细胞在第2－4d期间逐渐聚集，并自组装形成三维悬浮球状结构；待球状体形成后，将其转移至低生长因子Matrigel基质胶中进行三维培养，并更换HIO阶段培养基，以促进肠道结构的进一步生长与分化。
 

接下来通过qRT-PCR及免疫荧光检测各阶段关键基因的表达情况，以验证定向诱导的有效性。结果显示，与对照组相比，DE阶段标志基因FOXA2表达显著上调，同时期的免疫荧光染色观察到FOXA2阳性细胞，表明实现DE阶段的诱导。此外，与对照组相比，中肠/后肠阶段的标志性基因CDX2在MH阶段表达显著增强，免疫荧光染色也显示CDX2阳性细胞的大量存在，进一步确认了中肠/后肠诱导的成功。随后，在Matrigel基质胶中培养的HIO呈现出肠道特异性上皮蛋白的表达，并通过qRT-PCR检测到肠道成熟标志基因FOXF-1、LGR5、OLFM4、MUC2、SOX9和iFABP的表达相较对照组显著上调，表明类器官已成功进入功能成熟阶段。这些结果综合证明了人源肠道类器官的高效诱导与分化。
 

出自《５-氟尿嘧啶致人源肠道类器官损伤的研究》作者方佳瑞，李晓彤，朱恒。